Pozorovanie koloidných častíc pod mikroskopom: príprava preparátov, vlastnosti koloidov a pozorovacie metódy

K pozorovaniu koloidných častíc pod mikroskopom vedú dve rovnako dôležité cesty: správna teoretická orientácia v koloidnej chémii a precízna praktická príprava preparátov. V nasledujúcich kapitolách nájdete podrobné postupy prípravy natívnych i fixovaných preparátov, špecifiká pre elektrónovú mikroskopiu, dôležité kontroly mikroskopu pred prácou a prehľad základných fyzikálnych a chemických vlastností koloidných systémov, ktoré ovplyvňujú pozorovanie.

Príprava pracovného miesta a kontrola mikroskopu

• Pred pozorovaním je potrebné pripraviť nielen preparát, ale aj mikroskop. Prvá vec, ktorá by sa mala zistiť, je stav mikroskopu. Zistiť, či je v poriadku okulár a šošovky.
• Musí byť zaistená čistota pracovného stolíka.
• Ďalšou dôležitou vecou, pred začatím sledovania, je kontrola zdrojov osvetlenia. U zrkadlových mikroskopov sa musí dbať na čistotu zrkadla, rovnako tak by zrkadlo nemalo byť prasknuté.
• U LED osvetlenia potom skontrolujeme, či sú diódy v poriadku.
• Či už sa bude jednať o prípravu preparátov alebo mikroskopov, vždy dbajte predovšetkým na čistotu prostredia a nástrojov, rovnako tak ako na precíznosť.

Základné typy preparátov a ich použitie

Pri základnom rozdelení môžeme preparáty rozdeliť na dve skupiny - natívny preparát a fixovaný preparát. Ďalej môžeme preparáty rozdeliť podľa spôsobu prípravy na celkové (napr. jednobunkové organizmy), roztlakové preparáty a nátery (napr. rastlinné preparáty na pozorovanie delenia, krvné nátery, nátery exsudátu, hlienu a pod.), rezy a výbrusy (napr. histologické rezy z tkanív, výbrus kosti a zubov).

Natívny preparát

• V natívnom preparáte pozorujeme živé bunky v neporušenom stave, kde môžeme okrem ich tvaru, veľkosti a obsahu pozorovať aj ich prípadný pohyb, rast a množenie.
• Takýto preparát nájde svoje využitie hlavne v oblasti mikrobiológie, kde môžme sledovať rôzne baktérie, kvasinky, mikromycéty, riasy alebo aj parazity.
• Ich príprava je jednoduchá: pozorovaný objekt stačí umiestniť do kvapky vody alebo fyziologického roztoku (vytvoríme suspenziu) a dávať pozor, aby nám počas pozorovania nevyschol.
• Obzvlášť pri príprave natívnych preparátov mikroorganizmov používame prednostne fyziologický roztok (0,9% roztok NaCl). Fyziologický roztok (0,9% roztok NaCl) je isotonický a pri jeho použití nedochádza k poškodeniu buniek vplyvom osmotického tlaku.
• Pripravený preparát môžeme opatrne prikryť krycím sklíčkom, pričom musíme dávať pozor, aby nám pri prikrývaní nevznikali bublinky. Tie môžu pôsobiť rušivo pri pozorovaní preparátu pod mikroskopom. Ak sa stane, že nám nejaké vzniknú, môžme ich odstrániť opatrným tlakom na krycie sklíčko, čím ich z preparátu vytlačíme.
• Ak je potrebné, môžeme dopĺňať pri použití krycieho sklíčka vodu tzv. priesakovou metódou.
• Ďalším spôsobom prípravy natívneho preparátu je tzv. pozorovanie vo visutej kvapke. Tento spôsob je oproti tzv. „stlačenej kvapke“ vhodnejší najmä vtedy, keď potrebujeme preparát sledovať dlhšiu dobu, počas ktorej chceme zachytiť rast, pohyb, delenie buniek a pod.

Celkové preparáty, nátery a roztlakové preparáty

• Celkové preparáty sú preparáty pri ktorých pozorujeme celé organizmy, napr. jednobunkové riasy a sinice, prvoky, parazity. Príprava celkového preparátu je jednoduchá.
• Tieto preparáty sa pripravujú rozotretím suspenzie pozorovaných buniek (baktérie, prvoky, krvné elementy) do tenkej vrstvy na podložnom sklíčku buď pomocou bakteriálnej kľučky (rozter), alebo druhého podložného sklíčka (náter).
• Spravidla ide o fixované preparáty, ktoré môžeme následne podľa potreby zafarbiť príslušným farbením.
• Roztlakový preparát sa využíva hlavne v botanike pri pozorovaní mitózy a chromozómov. Pripravuje sa rozmačknutím pozorovaného materiálu do jednej tenkej vrstvy buniek.

Príprava podložných a krycích sklíčok, zhotovenie stlačenej kvapky

• Pred zhotovením samotného preparátu by sme si mali pripraviť podložné sklíčka. Najprv je ich potrebné riadne vyčistiť a naleštiť pomocou liehu.
• Následne, ak ideme pripravovať preparát na pozorovanie mikroorganizmov, ich tesne pred použitím dekontaminujeme pretiahnutím párkrát nad plameňom.
• Na vyčistené podložné sklíčko pomocou kvapátka kvapneme do stredu kvapku montovacieho média, v priemere asi 5-7 mm. V cvičení sa bude najčastejšie jednať o vodu, ale môže to byť napr. fyziologický roztok.
• Do kvapky vložíme vhodne upravený objekt (celý orgán, rez, stiahnutú pokožku, atď.) pomocou štetčeka alebo pinzety.
• Krycie sklíčko priložíme hranou ku kvapke média. To sa roztečie pozdĺž hrany krycieho skla. Krycie sklo potom podoprieme na protiľahlej strane preparačnou ihlou, ktorou opatrne a pomaly sklápame krycie sklo tak, aby sa v médiu neurobili bubliny.
• Ak je časť priestoru medzi sklami vyplnená vzduchom, je média málo a hrozí nebezpečie vyschnutia pozorovaného objektu. V tomto prípade pridáme opatrne kvapátkom kvapku k hrane krycieho skla tam, kde je tekutina a nie vzduch.
• Ak je média príliš veľa, krycie sklíčko "pláva" a pohybuje sa spolu s montovaným objektom. Ak sú v preparáte bubliny, je zvyčajne nutné ho premontovať.

Fixované preparáty: účel, metódy a domáce úpravy

Vo fixovanom preparáte pozorujeme štruktúru a jej zmeny pri patologickom procese. Fixácia je rýchle usmrtenie bunky, pri ktorom zabránime následným posmrtným zmenám (autolýze). Z tohoto dôvodu je potrebné dodržať čo najkratší predfixačný čas, t.j. čas medzi odobratím tkaniva, resp. uložením vzorky a jej fixáciou.

• Preparát (príp. vzorku tkaniva) môžeme fixovať fyzikálne (napr. rýchlym zmrazením so súčasným vysušením vo vákuu, teplom) alebo pomocou kvapalných chemikálií (napr. metanol, acetón, formaldehyd, fixačné zmesi) a ich pár.
• Tento spôsob fixácie sa využíva hlavne v mikrobiológii pri pozorovaní mikroorganizmov. Najskôr na podložné sklíčko nanesieme suspenziu (vzorku) skúmaného materiálu a kľučkou ju rozotrieme v tenkej vrstve po väčšej ploche. Vzorku necháme dôkladne zaschnúť.
• Preparát sa potom fixuje buď opakovaným pretiahnutím cez plameň kahana alebo pomalým zahriatím nad plameňom kahana (sporáku) po dobu asi 1 minúty. V oboch prípadoch pri fixácii dbáme na to, aby strana sklíčka s preparátom smerovala hore, t.j. smerom od plameňa. Tiež je potrebné sledovať teplotu pri fixácii, aby sa materiál neprehrial.
• Po zhotovení náteru sa preparát nechá zaschnúť a ponorí sa do acetónu na 2-10 minút. Acetón je dobré pred použitím nechať vychladiť v mrazničke na teplotu -20 °C. Tento spôsob nie je príliš vhodný, pretože môže spôsobovať zmrštenie tkaniva/buniek stratou vody a tukov.
• Ide o najpoužívanejší spôsob fixácie, hlavne pri príprave histologických a anatomických (makroskopických) preparátov. Používame 4-10% roztok pripravený zriedením koncentrovaného (40%) roztoku tečúcou vodou (nie destilovanou!).
• Samotnú fixáciu robíme ponorením vzorky (napr. celá ryba, prípadne jej časť) do fixačnej tekutiny na dostatočne dlhú dobu (jeden a viac dní v závislosti na veľkosti a druhu vzorky).

Zalievanie a príprava rezov pre svetelnú mikroskopiu

• Aby bolo možné z tkaniva zhotoviť tenké rezy (hrúbka bežných histologických preparátov sa pohybuje v rozmedzí cca 4-20 μm), je potrebné ho zaliať do látky, ktorá dobre vyplní všetky mikroskopické štrbiny a po stuhnutí je dobre rezateľná.
• V laboratórnej praxi sa najčastejšie používa zalievanie do parafínu. V domácich podmienkach je vhodnejšie zvoliť spôsob zalievania do želatíny.
• V našich improvizovaných podmienkach môžeme rezy z rastlinných pletív a tuhších tkanív (po fixácii a vypieraní fixačnej tekutiny) pripraviť jednoducho odrezaním veľmi tenkého plátku pomocou žiletky. Žiletku používame vždy novú, pretože aj okom neviditeľné naštrbenia nám môžu preparát znehodnotiť.
• Rez opatrne podlejeme niekoľkými kvapkami destilovanej vody a zahriatím sklíčka od spodnej strany na teplotu približne 56 °C rez vyrovnáme (napínanie a lepenie). Po vyrovnaní vodu spod rezu opatrne odsajeme pomocou savého papiera.

Príprava vzoriek pre elektrónovú mikroskopiu

• V elektrónovom mikroskope je preparát vystavený vákuu, vďaka ktorému by sa voda v preparáte uvoľňovala. Vďaka uvoľnenej vode by mohlo dôjsť hneď k niekoľkým problémom.
• Dôležitým predpokladom je, že preparát nebude obsahovať vodu. Dôležité je tiež, že preparát by rovnako nemal prekročiť veľkosť 100 nm. Keby bol preparát silnejší, elektróny by cez neho jednoducho neprešli.
• Pri príprave preparátu pre elektrónovú mikroskopiu začneme vyrezaním vhodnej veľkosti preparátu z iného, väčšieho. Orezanie sa vykonáva zásadne skalpelom.
• Ak sa bude jednať o bunky, musíme ich fixovať rôznymi roztokmi v rôznom zložení. Dôležitú úlohu hrá aj pH (kyslosť).
• Dehydratácia preparátu prebieha pomocou acetónu. Ten sa nariedi na rôzne koncentrácie, a bunka sa do neho jednoducho ponorí. Takto upravené vzorky potom fixujeme pomocou propylénoxidu.
• Bunky (tkanivo) sa zaleje do syntetickej živice, nasleduje polymerizácia. Po týchto úpravách vzorku orežeme na ultramikrotome.

Základné vlastnosti koloidných systémov dôležité pri pozorovaní

Koloidné systémy sú zmesi, ktoré sú nehomogénne z fyzikálneho aj chemického hľadiska. Vyznačujú sa špecifickým stupňom fázovej fragmentácie a je dôležité, aby jedna z fáz bola rozptýlená v druhej. Dispergovaná fáza je prítomná vo veľmi malých množstvách v porovnaní s druhou fázou, ktorá tvorí disperzné médium, ktoré je spojité.

• Systém možno definovať ako koloid, ak sa rozmery dispergovanej fázy pohybujú od 1 do 100 nm.
• Koloidný systém s jednotnými priemermi častíc sa nazýva monodisperzný systém.
• Koloidný systém s vodou ako disperzným médiom sa nazýva hydrosól. Ak je disperzným médiom organická kvapalina, koloidný systém sa nazýva organosól.
• Lyofilné koloidy sú také koloidy, ktoré sa vyznačujú afinitou k rozpúšťadlu. Na druhej strane lyofóbne koloidy nevykazujú žiadnu afinitu ku spojitej fáze. Ak je spojitou fázou voda, takéto lyofóbne koloidy sa označujú ako hydrofóbne.
• Molekulové koloidy (eukoloidy) sú tvorené molekulami zlúčenín (proteíny, kaučuk, škrob) dispergovaných v spojitej fáze.
• Fázové koloidy sa tvoria, keď sa okolo molekúl niektorých chemických zlúčenín zhromažďuje určitý počet atómov alebo molekúl, čím vznikajú agregáty rovnakej veľkosti ako koloidné molekuly.

Stabilita koloidov: koagulácia, peptizácia, Brownove pohyby

• Koagulácia je proces, pri ktorom sa jednotlivé častice dispergovanej látky spájajú a vytvárajú väčšie zhluky nazývané agregáty. Potom sa vyzrážajú zo systému vo forme sedimentu.
• Koagulácia môže byť ireverzibilná, kde sól po premene na koagulát nemôže obnoviť svoj pôvodný stav (výsledok neutralizácie povrchového elektrického náboja), alebo reverzibilná, kde koloidy premenené na koagulát môžu podliehať peptizácii, ktorá ich premení späť na sól.
• Brownove pohyby sú chaotické pohyby molekúl dispergovanej fázy v kvapalnej alebo plynnej spojitej fáze.
• Difúzia je charakteristika koloidných molekúl, ktoré sa pohybujú z oblasti s vyššou koncentráciou do oblasti s nižšou koncentráciou.
• Sedimentácia je účinok gravitácie pôsobiacej na molekuly koloidu, čo spôsobuje ich pád na dno nádoby.

Elektrické a elektrokinetické vlastnosti

• Elektrokinetický potenciál vzniká rozdielom potenciálu medzi stacionárnou difúznou vrstvou častíc dispergovanej fázy a dispergovanou fázou.
• Elektroforéza alebo „elektroforetická pohyblivosť“ je ďalšou charakteristikou koloidov. Elektroosmóza označuje pohyb kvapalnej fázy v jednotnom elektrickom poli.
• Streamovací potenciál je spôsobený mechanicky indukovaným prietokom kvapaliny cez systém kapilárnych trubíc alebo membrány.

Rozptyl svetla a význam plochy povrchu častíc

• Na rozdiel od skutočných roztokov sú častice v kvapalných koloidných systémoch dostatočne veľké na to, aby rozptýlili viditeľné svetlo. K tomu dochádza, keď sú indexy lomu média a dispergovanej fázy rozdielne. Kľúčovými faktormi rozptylu sú difrakcia a odraz.
• Plocha povrchu častíc je vlastnosť koloidu, ktorá priamo určuje schopnosť koloidu reagovať s prostredím. Plochu povrchu môžeme definovať ako celkovú plochu povrchu v cm² všetkých častíc prítomných v jednom mililitri koloidu.
• Schopnosť látky reagovať v určitom prostredí je možné určiť podľa plochy povrchu látok: reaktívnosť sa zvýši so zväčšením plochy povrchu.
• Plocha povrchu koloidných častíc sa zväčší, ak sa zmenšia rozmery častíc. Najvyššia plocha sa dosiahne pri vysokom obsahu nano-častíc a sub-nanometrových častíc.

Praktická poznámka z oblasti koloidného striebra (ilustračné súvislosti)

Profesor Ronald Gibbs vo svojej knihe zdôrazňuje, že veľkosť častíc v suspenzii koloidného striebra je veľmi dôležitá pre efektívnosť: plocha povrchu častíc je najdôležitejším parametrom. Produkty s vysokou hodnotou ppm nemusia byť efektívnejšie, ak sú častice veľké - majú menšiu celkovú plochu povrchu na jednotku obsahu. Plocha povrchu koloidných častíc sa zväčší, ak sa zvýši koncentrácia kovových častíc a ak sa zmenšia rozmery častíc.

Prečítajte si tiež: Bezpečnosť pri používaní koloidného striebra

Praktické rady pre domáce mikroskopovanie koloidných vzoriek

• Stále viac akvaristov vlastní doma svetelný mikroskop, alebo uvažuje o jeho kúpe. Aby však bolo možné mikroskop naplno využiť, je potrebné si vedieť správne pripraviť preparát, ktorý chceme pod ním pozorovať.
• Vzhľadom k tomu, že doma nemáme vybavenie na prípravu preparátov, aké sa používa v mikrobiologických a histologických laboratóriách (mikrotom, autotechnikon, termostat a pod.), budú niektoré návody značne improvizované a prispôsobené, aby mohli byť prevediteľné aj v domácich podmienkach.
• Pri príprave natívnych preparátov v domácich podmienkach používame často fyziologický roztok, čisté sklíčka, dekontamináciu plameňom tam, kde je to potrebné, a dbáme na to, aby preparát počas pozorovania nevyschol.

Krátka tabuľka: porovnanie vybraných typov preparátov

Typ preparátu	Hlavné využitie	Výhody	Nevýhody
Natívny preparát	Mikrobiológia, sledovanie živých buniek	Jednoduchá príprava, sledovanie pohybu a rastu	Nízka trvanlivosť, riziko vyschnutia
Fixovaný preparát (náter/rozter)	Identifikácia štruktúr, farbenie	Stabilita, možnosť farbenia	Nutnosť fixácie, možné artefakty
Histologický rez	Štruktúrne a patologické hodnotenie tkaniva	Zachovaná morfológia, detailné pozorovanie	Technicky náročné, potreba fixácie a zalievania
Príprava pre EM	Pozorovanie nano-častíc a ultrastruktúr	Veľmi vysoké rozlíšenie	Vysoká náročnosť, nutnosť bezvodej vzorky a tenkého rezu

Krátke odporúčania pred každým pozorovaním

1. Skontrolujte čistotu okulárov, šošoviek a stavu osvetlenia mikroskopu.
2. Pripravte si čisté podložné sklíčko a krycie sklíčko; podložné sklíčka riadne vyčistite liehom.
3. Vyberte vhodné montovacie médium (voda, fyziologický roztok) podľa typu vzorky.
4. Pri pozorovaní citlivých alebo živých koloidných systémov používajte natívne preparáty; pri potrebe detailného zobrazenia použite fixáciu a farbenie alebo EM prípravu.
5. Dbajte na to, aby v prípade elektronovej mikroskopie bola vzorka bez vody a dostatočne tenká (≤100 nm).

Pozorovanie koloidných častíc pod mikroskopom kombinuje pochopenie fyzikálno-chemických vlastností koloidov s precíznou praxou pri príprave preparátov. Dodržiavaním uvedených postupov a zásad môžete získať kvalitné pozorovania - od živých natívnych preparátov cez farebné nátery až po ultrastrukturálne snímky v elektrónovom mikroskope.

Prečítajte si tiež: Výhody Koloidných Minerálov

Prečítajte si tiež: Výroba koloidného striebra

tags: #koloidne #castice #pod #mikroskopom